untersuchte die oligomere Struktur, die regulatorischen Eigenschaften und Expressionsmuster von HSK1 von C. reinhardtii (CrHSKl) als Modell eukaryotischer Mikroorganismen. Das vorhergesagte HSK1-Polypeptid (A8I826_CHLRE) kodiert durch die C. reinhardtii HSK1 cDNA beträgt 358 aa mit einem berechneten Molekulargewicht von 36229 Da. Repräsentative pflanzliche und bakterielle HSK-Sequenzen wurden an der Chlamydomonas HSK-Sequenz ausgerichtet (Abb. 2). Zwei Domänensequenzen sind aus den Aminosäuren 126 bis 191 (GHMP_kinases_N) und von 258 bis 336 (GHMP_kinases_C) zu erkennen, die CrHSK als Mitglied der Familie der GHMP-Überfamilie identifizieren (Zhou et al., 2000). Extrem hohe lokale Identitäten treten über das Signaturmuster [LIVM]-[PK]- Homoserinkinase in Chlamydomonas reinhardtii auf: Biochemische Charakterisierung und Expressionsmuster sind auf dem Enzym von photosynthetischen eukaryotischen Mikroorganismen verfügbar. In dieser Arbeit zeichnete sich HSK1 von C. reinhardtii durch seine Regulations- und Ausdrucksmuster aus. Ein phylogenetischer Baum wurde auf der Grundlage der primären Sequenzen von HSKs mit der Neighbor-Joining-Methode (Saitou und Nei, 1987) mit der phylogenetischen Software MEGA7 (Kumar et al., 2016) konstruiert. Der Prozentsatz der Replikationsbäume, für die die zugehörige Taxa im Bootstrap-Test gruppiert ist (1000 Replikationen), wird neben den Zweigen angezeigt (Abb. 3).

Der Baum wird maßstabsgetreu gezeichnet, mit Zweiglängen in den gleichen Einheiten wie die evolutionären Entfernungen, die verwendet werden, um den phylogenetischen Baum abzuleiten. GenBank-Beitrittsnummern: Chlamydomonas reinhardtii (EDP06874), Chlorella variabilis (EFN56255), Ostreococcus tauri (XP_003079613), Physcomitrella patens (EDQ61255), Ricinus communis (XP_002517698), Arabidopsis thaliana (AAD33097), Oryza sativa japonica (XP_015624618), Solanum lycopersicum (XP_004236876), Vitis vinifera (XP_010656617), Populus trichocarpa (ERP62652), Ralstonia solana-cearum (AMP73326), Synechococcus elongatus Lee M., Martin M.N., Hudson A.O., Lee J., Muhitch M.J. und Leustek T. 2005. Methionin und Threonin Synthese sind durch Homoserin Verfügbarkeit begrenzt und nicht die Aktivität der Homoserin kinase in Arabidopsis thaliana. Anlage J. 41, 685-696. Abb. 7. Die Auswirkungen von exogenem H2O2 auf die Transkriptakkumulation.

a – Die relativen Transkriptsstufen von CrHSKl (weiße Balken) und HSP90C (graue Balken). Chlamydomonas-Zellen wurden 1 mM H2O2 ausgesetzt. CrRACKl wurde als interne Kontrolle verwendet. Die Stäbe sind Mittel zur relativen Faltenveränderung von drei biologischen Replikationen, die durch Echtzeit-RT-PCR erhalten wurden; b – die relativen Transkriptsniveaus von CrHSP70A; c – die relativen Transkriptsebenen von CrMSD3. Abb. 5. Gelfiltrationschromatographie der gereinigten His6CrHSK1-tp. a – Standard-Kalibrierkurve, die Daslionsvolumen und molekulare Größenmarkerproteine darstellt: Ribonuklease (13,7 kDa), Kohlensäureanhydrase (29 kDa), Conalbumin (75 kDa), Aldolase (158 kDa), Ferritin (440 kDa); b – chromatographisches Plotelutionsvolumen (Ve/V0) versus Absorption (mAU) des CrHSK1-Proteins, mit dimerer Spitze, die dem 62,71 kDa entspricht. Die native Größe von dimeric CrHSKl wird in (a) gesehen. Homoserinkinase (EC 2.7.1.39, HSK) produziert O-Phospho-L-Homoserin, ein Astpunkt zwischen den Wegen für Methionin (Met) und für Threonin (Thr)/Isoleucin (Ile) in photosynthetischen Eukaryoten. Obwohl HSKs in Bakterien, Archaeen und höheren Pflanzen beschrieben wurden, wurde bisher kein HSK-Homolog in Grünalgen charakterisiert. In der einzelligen grünen Alge Chlamydomonas reinhardtii wird die HSK1 durch ein Kerngen CrHSK1 kodiert.

Aus der Analyse der Lokalisationen für homologe Proteine in höheren Pflanzen Chlamydomonas HSK wird als Chloroplastprotein vorhergesagt. Der N-terminale Teil von CrHSK1 bis zum Rückstand Alanin 31 wird vorhergesagt, um ein Chloroplasttransitpeptid zu kodieren, das im reifen Protein gespaltet ist. Die C. reinhardtii HSK1 (CrHSK1) wurde geklont und mit einem C-Terminal-verschmolzenen His6-Tag überexprimiert. Die Gelfiltration zeigte die oligomere Struktur von CrHSK1 als Homodimer. CrHSK1 hat ein scheinbares Km für L-Homoserin von 0,107 mM und für ATP von 0,2 mM und benötigte K+ und Mg2+ für die Aktivität.